其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基（3′-OH）末端摻入生物素（Biotin）標(biāo)志的dUTP，隨后通過Biotin與連接辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生深棕色的不溶物，從而特異準(zhǔn)確地定位凋亡的細(xì)胞。

本試劑盒可用于石蠟切片、冰凍切片和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或爬片）的凋亡原位檢測，檢測結(jié)果可在普通光學(xué)顯微鏡下直接觀察計(jì)數(shù)。
包裝清單：

產(chǎn)品組成：

保存條件：

Streptavidin-HRP, 4℃, 其余試劑-20 ℃保存，一年有效。

操作步驟：

1、樣本處理：

a) 石蠟切片：經(jīng)二甲笨、酒精脫蠟，復(fù)水。脫蠟應(yīng)充分。

b) 冰凍切片：流水沖洗，去除OCT包埋膠后，用純水洗3次。

c) 細(xì)胞飛片：用組織固定液固定后，用PBS洗三次，每次5分鐘。1% Triton X-100處理10分鐘，用PBS洗三次，每次5分鐘。

2、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋于50ul PBS中，滴加到組織上，37℃孵育10-20分鐘。消化結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

3、封閉

用3%的雙氧水（H2O2）室溫封閉10分鐘，封閉結(jié)束后用PBS洗三次，每次5分鐘。

4、陽性對(duì)照組織的處理

將組織用DNase I消化，以獲得斷裂的DNA，即成Tunel染色陽性的對(duì)照。陽性對(duì)照組織也可以選用小鼠的小腸組織切片。

將50 ul DNase I消化液滴加于組織上，37℃孵育10-30分鐘，消化結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

5、連接:

連接反應(yīng)前用50 ul Equilibration Buffer孵育標(biāo)本5-10分鐘。孵育過程中按下表配制連接工作液。去除標(biāo)本上的Equilibration Buffer后，直接滴加50ul 連接工作液，37℃孵育1-2小時(shí)，染色結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

6、標(biāo)志

取1 ul 試劑（I）Streptavidin-HRP加入到50ul PBS 中，混勻后滴加至組織上，37℃避光孵育30分鐘，隨后用PBS洗三次，每次5分鐘。

7、顯色

取50 ul 試劑（J）DAB-A solution 與2.5 ul 試劑（K）DAB-B solution混勻后，滴加至組織上，室溫顯色反應(yīng)30秒至5分鐘。顯色結(jié)束后，用PBS洗三次，每次5分鐘

8、蘇木素復(fù)染

每組織上滴加數(shù)滴Mayer’s蘇木素染色液，染色1-5分鐘，隨后用自來水沖洗反藍(lán)，如蘇木素染色過深，可用1%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒，再次反藍(lán)；如蘇木素染色過淺，可用蘇木素再次染色，并延長染色時(shí)間。

9、封片觀察

經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，滴加中性樹膠，加蓋玻片封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

注意事項(xiàng)：

1、Proteinase K 消化時(shí)間需要摸索，冰凍切片 10 min 左右，石蠟切片時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長。

2、陰性對(duì)照體系：配制連接工作液時(shí)用純水替代TdT Enzyme。

3、連接與標(biāo)志反應(yīng)時(shí)應(yīng)注意避光。

4、實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)穿戴手套、實(shí)驗(yàn)服等，做好個(gè)人防護(hù)。

備注：

         產(chǎn)品信息可能會(huì)有優(yōu)化升級(jí)，請(qǐng)以實(shí)際標(biāo)簽信息為準(zhǔn)。

本產(chǎn)品僅供科研使用。請(qǐng)勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請(qǐng)勿存放于普通住宅區(qū)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)過程中做好防護(hù)工作。